iTRAQ(Isobaric Tag for Relative Absolute Quantitation)和TMT(Tandem Mass Tags)技術是生物學領域(yu)應(ying)用廣泛的兩種蛋白質標記定量技術。iTRAQ/TMT試(shi)劑由報告基(ji)(ji)團、平衡基(ji)(ji)團和(he)反應(ying)基(ji)(ji)團三個基(ji)(ji)團構成。反應(ying)基(ji)(ji)團與肽段相連接使iTRAQ/TMT試劑(ji)結合在肽(tai)段上(shang)，在一(yi)級譜(pu)圖中，不(bu)同(tong)樣(yang)本的(de)(de)同(tong)一(yi)肽(tai)段，標(biao)記后表現為相(xiang)同(tong)的(de)(de)質荷比(bi)。在二級譜(pu)圖中，報告基團(tuan)、平衡基團(tuan)和反應基團(tuan)之間的(de)(de)鍵斷(duan)裂，帶(dai)不(bu)同(tong)同(tong)位素標(biao)簽的(de)(de)同(tong)一(yi)肽(tai)段產生(sheng)質量不(bu)同(tong)的(de)(de)報告離(li)子，根據報告離(li)子的(de)(de)豐度(du)可獲得樣(yang)本間相(xiang)同(tong)肽(tai)段的(de)(de)定量信息。
質譜儀
FusionLumos、Q Exactive HF、Oribtrap、Q TOF 6600
技術優勢
定量準確：基于高效的鑒定軟件和嚴格的過濾條件，控制鑒定結果的可靠性
適用性廣：適用于所有物種的各類樣本
檢(jian)(jian)測通量(liang)高：一(yi)次可檢(jian)(jian)測8個樣本(ben)
蛋白數量(liang)多：能鑒定高達10000種蛋白
技術流程
實驗流程
信息分析
生信分析總流程
標準信息分析
（1）蛋白鑒定(ding)
（2）蛋白功能(neng)注釋
（3）蛋白亞細胞定位
（4）蛋白(bai)定量
（5）差異蛋(dan)白篩選
（6）蛋白互作
個性化分析
（1）蛋白組+轉錄組關聯分析
（2）其余個性(xing)化分(fen)析
分析結果示例
案例分析
案例（1）腫瘤(liu)內皮細胞來(lai)源(yuan)的(de)cadherin-2促(cu)進血管生(sheng)成，對(dui)肺(fei)腺癌有預后意(yi)義
本(ben)研究選(xuan)取腺(xian)肺癌臨床(chuang)組織分離(li)的(de)TECA（癌(ai)組織(zhi)(zhi)分(fen)(fen)(fen)離血(xue)(xue)管(guan)內皮細(xi)(xi)胞）、PECA（癌(ai)旁組織(zhi)(zhi)分(fen)(fen)(fen)離血(xue)(xue)管(guan)內皮細(xi)(xi)胞）及NECA（正常(chang)組織(zhi)(zhi)分(fen)(fen)(fen)離血(xue)(xue)管(guan)內皮細(xi)(xi)胞）進行iTRAQ蛋白(bai)(bai)組學分(fen)(fen)(fen)析和(he)實驗(yan)驗(yan)證(zheng)，發現血(xue)(xue)管(guan)蛋白(bai)(bai)Cadherin-2（CDH2）在(zai)肺(fei)(fei)癌(ai)組織(zhi)(zhi)和(he)細(xi)(xi)胞中(zhong)顯(xian)著上調(diao)。通過(guo)結(jie)合過(guo)表(biao)(biao)達實驗(yan)和(he)臨(lin)床樣本(ben)評估(gu)結(jie)果，確認CDH2降解及表(biao)(biao)達的(de)(de)異(yi)質性導致(zhi)了與癌(ai)細(xi)(xi)胞粘附(fu)和(he)細(xi)(xi)胞遷移(yi)/增殖相(xiang)關的(de)(de)不同調(diao)控行為。研究為證(zheng)實cadherin-2作為腺肺(fei)(fei)癌(ai)臨(lin)床診斷新的(de)(de)分(fen)(fen)(fen)子(zi)靶標提供理論基礎。
圖1 差異蛋白(bai)表達(da)熱圖和不同樣本(ben)組蛋白(bai)數(shu)據(ju)的PCA分析
案例（2）WDR74通過RPL5-MDM2-p53通路調(diao)節黑(hei)素瘤的(de)發生和轉移
本研究對小(xiao)鼠黑(hei)色素瘤細胞株和黑(hei)色素瘤轉移細胞株進行iTRAQ蛋白組(zu)學分析和(he)qPCR、免疫印跡(ji)等實驗(yan)，發現并驗(yan)證了WDR74能(neng)促進細胞周期的(de)進展和(he)細胞增殖，并通過(guo)過(guo)表達(da)和(he)敲除實驗(yan)等揭示(shi)了WDR74對RPL5-MDM2-p53通路的(de)調控作用。WDR74及其機(ji)制的(de)研究為(wei)WDR74作為(wei)臨床預防(fang)和(he)治療黑素瘤的(de)候選靶點提(ti)供理論依據。
圖2 通過iTRAQ檢測到WDR74的電離肽的注釋(shi)質譜
圖3 WDR74調(diao)控RPL5-MDM2-p53通路(lu)機制圖
案(an)例（3）利用(yong)串聯質譜(pu)標簽(TMT)標記揭(jie)示小鼠附睪脂(zhi)肪組織中年齡和高(gao)脂(zhi)飲食特異性蛋白質(zhi)組的變化(hua)
本研(yan)究主要從不同(tong)年齡(ling)的高脂(zhi)與低脂(zhi)小鼠中分(fen)離附睪(gao)脂(zhi)肪組織(zhi)，采用TMT標(biao)記法探(tan)索(suo)年齡(ling)和(he)高脂(zhi)飲食(shi)對(dui)附睪組織中蛋白(bai)質的(de)變化。揭示(shi)出長(chang)期(qi)高脂(zhi)飲食(shi)顯著改變了(le)55種(zhong)與免疫應(ying)(ying)答和(he)腎素-血(xue)管(guan)緊張素系統相(xiang)關的(de)蛋白(bai)質，確(que)定了(le)與年齡(ling)相(xiang)關和(he)高脂(zhi)肪飲食(shi)特異性蛋白(bai)質組學(xue)特征，突出了(le)精氨(an)(an)酸代謝對(dui)年齡(ling)增長(chang)的(de)響(xiang)應(ying)(ying)，以及支鏈氨(an)(an)基酸代謝對(dui)高脂(zhi)肪喂養(yang)的(de)早期(qi)響(xiang)應(ying)(ying)。
圖4 附睪脂肪蛋(dan)白(bai)質(zhi)組中(zhong)飲(yin)食和(he)年齡相關變化比較(jiao)的(de)實驗(yan)設置和(he)工作流程
[1] Zhuo H, et, al. Tumor endothelial cell-derived cadherin-2 promotes angiogenesis and has prognostic significance for lung adenocarcinoma[J]. Molecular Cancer, 2019, 18:34.
[2] Li Y, et, al. WDR74 modulates melanoma tumorigenesis and metastasis through the RPL5-MDM2-p53 pathway[J]. Oncogene, 2020, 39: 2741-2755.
[3] Plubell D L, Wilmarth P A, Zhao Y , et al. Extended Multiplexing of Tandem Mass Tags (TMT) Labeling Reveals Age and High Fat Diet Specific Proteome Changes in Mouse Epididymal Adipose Tissue[J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2017, 16(5):873-890.
