傳統的(de)(de)(de)高通量(liang)測(ce)序(xu)(xu)是對某一組織(zhi)整體的(de)(de)(de)細胞合集進行測(ce)序(xu)(xu)和(he)分析，而某一個(ge)細胞的(de)(de)(de)基(ji)因信息則(ze)會被整體覆蓋。隨著高通量(liang)測(ce)序(xu)(xu)技術的(de)(de)(de)發展，人們對基(ji)因組與(yu)表(biao)型之間(jian)的(de)(de)(de)關系認識越來越深刻，單個(ge)細胞也有可(ke)能攜帶重要(yao)的(de)(de)(de)信息。
10x單(dan)細胞測序是使用10x Genomics平臺，將單細胞(bao)(bao)懸液(ye)中的(de)每個細胞(bao)(bao)分別進行標記，再通過逆轉錄和PCR建庫測序，分析單(dan)(dan)個(ge)細胞(bao)(bao)的(de)(de)轉錄組信息(xi)。單(dan)(dan)細胞(bao)(bao)測序可以揭示復雜細胞(bao)(bao)群(qun)體的(de)(de)異質性，避免單(dan)(dan)個(ge)細胞(bao)(bao)的(de)(de)基因表達信號被群(qun)體的(de)(de)平(ping)均化所掩蓋(gai)。
1、10x單細胞轉錄組測序(xu)實驗方案
測序(xu)策(ce)略：Illumina平臺PE150
數(shu)(shu)據(ju)量與捕獲的(de)細胞數(shu)(shu)量相關，捕獲細胞越(yue)(yue)多，產(chan)生(sheng)的(de)數(shu)(shu)據(ju)量也越(yue)(yue)多，具體如下：
2、單細胞轉錄組測序技(ji)術優勢
（1）精準分選：利用10x Genomics平臺，實現(xian)真正的(de)單細胞測序；
（2）細胞捕獲率高(gao)達(da)65%，可實現大量單細胞的快速高效標(biao)記(ji)、測(ce)序和(he)分析；
（3）項(xiang)目周期短，技術(shu)應用范圍(wei)廣。
3、送樣(yang)建(jian)議(yi)
細胞樣本(ben)
聯系我(wo)們上門服務（提前10個工作日預約）。
血液(ye)樣本(ben)
抽取5ml人外(wai)周血(xue)加入到(dao)EDTA抗凝管中，分離PBMC后，聯系我們上門服務（提前(qian)10個工作日預約）。
組(zu)織樣本
方案一：取新鮮組織(zhi)進(jin)行組織(zhi)解(jie)離后，制備為(wei)細胞(bao)懸(xuan)液，聯系我們上門服務（提前10個工作(zuo)日預約）；
方案二：新(xin)鮮組(zu)織取黃豆(dou)大小（1-2mm3）剪碎后置于保存液（公司提供(gong)）中，48h內冰袋運(yun)輸到我司。每(mei)個樣本至少準備兩管，一管作(zuo)為備份。
注意事項：冰袋若從-80℃拿出，需(xu)放(fang)4℃冰箱2h。
4、技術(shu)流程
5、單細(xi)胞轉(zhuan)錄(lu)組測序信息分析
1測序數據質控和定量
1.1測序序列(lie)統計與(yu)質控(kong)
1.2數據定量
1.3多樣本數(shu)據合并和定量(liang)均(jun)一化
1.4最終鑒定細胞(bao)表達量矩(ju)陣
2細胞亞群分類
2.1細胞過(guo)濾
2.2單細胞亞群(qun)分類(lei)
3 Marker基因分析
4差異(yi)富集分析
4.1差異基因GO富集(ji)性分析
4.2差(cha)異基因(yin)KEGG富集性分析
5高級分析
5.1已(yi)知基因在細胞亞群表達分布(bu)及熱圖
5.2細胞分化擬時序分析
5.3細(xi)胞相互(hu)作用圖譜(pu)
5.4加(jia)權基因共(gong)表(biao)達（WGCNA）分析
5.5蛋白質互(hu)作(zuo)網(wang)絡分析
5.6細胞周期鑒定
6、結果(guo)展(zhan)示(shi)
圖1 PCA基因熱(re)圖(tu)
圖2 單細胞亞(ya)群分類tSNE圖
圖3 擬時序(xu)軌(gui)跡圖
（擬時(shi)序分(fen)析（pseudotime），即構建(jian)細胞(bao)(bao)(bao)譜系發育，主要是(shi)判斷不(bu)同細胞(bao)(bao)(bao)表(biao)達量之(zhi)間(jian)的(de)關系，不(bu)同亞群之(zhi)間(jian)表(biao)達量過渡(du)的(de)變化(hua)就是(shi)一條軌跡，這個時間(jian)并不(bu)是(shi)真的(de)時間(jian)，而是(shi)一個虛(xu)擬的(de)時序(xu)列，是(shi)指細胞(bao)(bao)(bao)與細胞(bao)(bao)(bao)之(zhi)間(jian)的(de)轉化(hua)和演替(ti)的(de)順序(xu)和軌跡。Monocle是我(wo)們經常用的(de)擬(ni)時序分析工具(ju)，通過R語言讀取(qu)seurat對象(xiang)后可(ke)進行數據分析，基(ji)于(yu)某些Marker基因表(biao)達模式，進而描繪細胞在隨時間發育過(guo)程的動(dong)態變(bian)化。）
圖4 擬時序(xu)變化相關基因（Top10\ Top50）表(biao)達分布(bu)圖(tu)\熱(re)圖(tu)
7、單細胞轉錄組測序案例分析
Nature Immunology狼(lang)瘡性腎炎(yan)患者(zhe)的腎臟免疫(yi)細(xi)胞組成單(dan)細(xi)胞測序分析
圖(tu)5 細胞亞型聚(ju)類圖
通(tong)過對LN患者和(he)(he)健康個體的(de)(de)腎(shen)(shen)臟(zang)(zang)(zang)、血(xue)液和(he)(he)尿液樣(yang)本進行單細胞轉錄(lu)組測序分析，結果顯示，血(xue)液與腎(shen)(shen)臟(zang)(zang)(zang)中檢(jian)測到的(de)(de)細胞分子特征存在相似性和(he)(he)差異性，而尿液與腎(shen)(shen)臟(zang)(zang)(zang)中白(bai)細胞亞群的(de)(de)分子活化狀(zhuang)態高度相關，有望作為腎(shen)(shen)臟(zang)(zang)(zang)活檢(jian)的(de)(de)代(dai)替物。
使用低分辨率聚類將所取腎(shen)臟細胞分為了10個(ge)集(ji)群，基于(yu)譜系標記基因和其他基因上調，將集(ji)群標記為髓細胞（C4, C6）、T/NK細胞(bao)（C0, C1, C2, C5）、B細胞（C3, C8）、分裂細(xi)胞(bao)（C9）和腎上皮細胞（C7）。接下來，將每個(ge)譜(pu)系的細胞(bao)分別進行聚類，一共確定了21個免疫(yi)細胞集群(qun)和一個上皮(pi)細胞集群(qun)（圖2）。
研究利用單細胞(bao)轉錄組學研究從LN患者和活(huo)體(ti)供體(ti)對照中(zhong)獲得的腎臟樣本，揭示了LN腎臟免疫群體的復雜性(xing)，識別(bie)了髓細胞、NK細胞、T細胞(bao)和B細(xi)胞等多種(zhong)疾(ji)病特(te)異性(xing)亞群。研究發(fa)現：大量的分裂細(xi)胞和NK細胞，表明IFNγ和細(xi)胞溶解分子(zi)的主要來源，CD8+ T細(xi)胞中衰(shuai)竭標記(ji)的少量表達(da)表明了LN中(zhong)的細胞毒性。浸潤白細胞的干擾(rao)素反應(ying)特(te)征與(yu)血液(ye)中(zhong)的相同(tong)特(te)征相關，趨化(hua)因子受(shou)體(ti)CXCR4和CX3CR1在腎臟免(mian)疫(yi)細(xi)胞(bao)中(zhong)頻繁表達(da)(da)，提示它(ta)們可能是(shi)潛在的治(zhi)療靶(ba)點，尿液免(mian)疫(yi)細(xi)胞(bao)基因表達(da)(da)與(yu)相應(ying)的腎臟白細(xi)胞(bao)高度相關。
參考文(wen)獻 ：
[1] Arazi A., Rao, D. A., et al. (2019). The immune cell landscape in kidneys of patients with lupus nephritis. Nature Immunology.
