2018-08-01
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為(wei)抵御各種(zhong)各樣(yang)的(de)(de)(de)病原體，人類或(huo)(huo)哺(bu)乳動物(wu)的(de)(de)(de)適應性(xing)免(mian)疫系統擁有大量的(de)(de)(de)T細(xi)(xi)(xi)胞(bao)受體(TCRs)和(he)B細(xi)(xi)(xi)胞(bao)受體(BCRs)，統稱為(wei)免(mian)疫組(zu)庫。高通(tong)量測(ce)序（NGS）技術(shu)允許對(dui)T或(huo)(huo)B細(xi)(xi)(xi)胞(bao)克隆進行深入分析，能(neng)夠(gou)在檢測(ce)T或(huo)(huo)B細(xi)(xi)(xi)胞(bao)時(shi)提供(gong)前所(suo)未有的(de)(de)(de)精細(xi)(xi)(xi)度。
該技(ji)術可(ke)以有(you)效評(ping)(ping)估TCR或(huo)BCR互補決定區域(CDR3)的(de)(de)多(duo)樣(yang)性(xing)(xing)，并評(ping)(ping)估克(ke)(ke)隆類(lei)型的(de)(de)構成：包括特定克(ke)(ke)隆類(lei)型的(de)(de)比例；克(ke)(ke)隆之間的(de)(de)相(xiang)似程度(du)；V(D)J基因的(de)(de)使用頻率；核苷酸插入與缺(que)失；CDR3區域長(chang)度(du)分(fen)布等(deng)信息。因此，免(mian)疫組庫高通量測序為評(ping)(ping)估健康或(huo)疾(ji)病狀態下的(de)(de)機體適應(ying)性(xing)(xing)免(mian)疫系統(tong)提供了可(ke)能。
高通(tong)量(liang)測序技術可快速便捷地(di)對免疫組庫進行全景式的掃描，但其涉(she)及(ji)的PCR反(fan)應會(hui)導(dao)致假陽性增(zeng)加以及(ji)擴增(zeng)偏倚(yi)，從而對數(shu)據結果的準確(que)性造成潛在(zai)影響。
目前(qian)，現有(you)的免疫組庫技術主要分為兩(liang)類：
1.基于(yu)多重PCR的文庫(ku)構(gou)建(jian)方案：以DNA為模板(ban)，針對(dui)可變區(qu)（CDR3）設(she)計多對(dui)引物，擴增(zeng)出CDR3區(qu)段，再(zai)進行文庫(ku)構(gou)建(jian)并(bing)測序；
2.基(ji)于5'RACE的(de)文(wen)庫(ku)(ku)構(gou)建方案(an)：以mRNA為模板(ban)，在恒定區設計引物逆轉(zhuan)錄擴出TCR或(huo)BCR的(de)全長序(xu)列，經過兩輪PCR富集這一目的(de)序(xu)列，再進行文(wen)庫(ku)(ku)構(gou)建并測序(xu)。
但(dan)是，現有的基于(yu)多重PCR的文庫構建方(fang)案存(cun)在明顯不(bu)足之處：該方(fang)法同(tong)時進行(xing)幾十(shi)種引物的擴增(zeng)(zeng)，體系異常復雜；多重引物設(she)計需已(yi)知參(can)考序(xu)列，不(bu)能充分捕(bu)捉(zhuo)到人(ren)類等(deng)位基因突變序(xu)列；多種引物擴增(zeng)(zeng)效率可能存(cun)在偏(pian)倚(yi)，難(nan)以等(deng)效擴增(zeng)(zeng)；與使用mRNA構建文庫相比，DNA所需的PCR反應(ying)體系較大，樣本(ben)要求較高。
技術升級一：
廣州華銀(yin)健康科技有限公(gong)司(si)推出全新的免(mian)疫組庫測序技術服務，基于5'RACE原理，并在原始模(mo)板擴增(zeng)前(qian)引(yin)入(ru)UMI（Unique Molecular Indices，分(fen)子條(tiao)形碼）進行文庫構建：以恒定區單引(yin)物逆轉(zhuan)錄擴增(zeng)出CDR區
域(yu)全長序(xu)列的同時，引入UMI序(xu)列，可對后續PCR反應(ying)或測序(xu)過程中引入的錯誤進行有效糾正，從(cong)而提高(gao)準確率(lv)。
技術升級二：
在逆(ni)轉錄環節，廣州華銀健康科技有限公(gong)司(si)設(she)計了(le)針對微(wei)量(liang)樣品（低至(zhi)100個細(xi)胞）的(de)實(shi)驗流程：即通(tong)過(guo)oligo dT磁珠捕(bu)獲mRNA，以磁珠上的(de)oligo dT為逆(ni)轉錄引物(wu)合成(cheng)cDNA，并純化回(hui)收cDNA，較常(chang)規方(fang)法可(ke)大大提高效(xiao)率(lv)，保證了(le)人或小鼠(shu)來源的(de)微(wei)量(liang)樣品的(de)實(shi)驗成(cheng)功率(lv)。
全新免疫組庫測序技術服務亮點
1.可滿足微量樣品建庫的實驗要求（最低可至100個細胞），兼容人以及小鼠樣本
微(wei)量RNA起始建庫流程圖
2.低RNA起始量的樣本也能快速達到測序飽和期，相同RNA起始量下的樣本其相關度較高
同一樣(yang)本RNA起始量不同時到達測序飽和期數據統計曲線圖
同一樣(yang)本RNA起始量(liang)相同時樣(yang)本間的(de)相關性圖
（A1/A2/A3為(wei)(wei)(wei)起(qi)始(shi)RNA量為(wei)(wei)(wei)1600ng; B1/B2/B3為(wei)(wei)(wei)起(qi)始(shi)量為(wei)(wei)(wei)400ng; C1/C2/C3為(wei)(wei)(wei)起(qi)始(shi)量為(wei)(wei)(wei)50ng）
3.基于強大的UMI標記與校正算法，可有效糾正PCR與測序過程引入的錯誤與偏倚，極大地提高準確度
經過UMI算法校(xiao)正(zheng)后的部分測試數(shu)據(ju)統計(ji)表
4.對測序下機數據進行多維度分析，給出最全面的數據結果報告，并可定制個性化分析服務
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